一、絕對定量法：外標(biāo)法/內(nèi)標(biāo)法

原理：通過建立目標(biāo)分析物濃度與儀器響應(yīng)值（峰面積/峰高）之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算未知樣品中該物質(zhì)的絕對含量。

1.外標(biāo)法(ExternalStandardMethod)

*操作：配制一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在與待測樣品完全相同的色譜、質(zhì)譜條件下進(jìn)樣分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（濃度vs.響應(yīng)值）。將待測樣品的響應(yīng)值代入曲線方程計(jì)算濃度。

*優(yōu)點(diǎn)：操作簡單，成本低，無需特殊標(biāo)記試劑。

*缺點(diǎn)：

*易受基質(zhì)效應(yīng)影響（樣品基體可能抑制或增強(qiáng)離子化效率）；

*進(jìn)樣誤差直接影響結(jié)果準(zhǔn)確性；

*對儀器穩(wěn)定性要求高。

*適用場景：基質(zhì)簡單、通量高的小分子定量（如藥物代謝物、環(huán)境污染物）。

2.內(nèi)標(biāo)法(InternalStandardMethod,IS)

*操作：在樣品和標(biāo)準(zhǔn)品中加入穩(wěn)定同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)物（如13C、1?N標(biāo)記的同類化合物）。以內(nèi)標(biāo)物的響應(yīng)值為參照，計(jì)算目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)的響應(yīng)比值，再通過比值-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。

*優(yōu)點(diǎn)：

*顯著抵消基質(zhì)效應(yīng)和儀器波動(dòng)的影響；

*減少進(jìn)樣誤差；

*準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好。

*缺點(diǎn)：同位素內(nèi)標(biāo)合成成本高，且需化學(xué)性質(zhì)與目標(biāo)物高度匹配。

*適用場景：復(fù)雜基質(zhì)（如血漿、組織）中的精準(zhǔn)定量（如臨床藥物檢測、生物標(biāo)志物驗(yàn)證）。

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二、相對定量法：標(biāo)記法vs.非標(biāo)記法

原理：比較不同樣品中同一目標(biāo)物的相對豐度差異，適用于組學(xué)研究中大規(guī)模目標(biāo)物的并行分析。

1.標(biāo)記法(如TMT/iTRAQ)

*操作：對不同樣品中的蛋白質(zhì)/多肽進(jìn)行化學(xué)同位素標(biāo)記（如TMT10/11-plex），標(biāo)記后混合為單一樣品進(jìn)行LC-MS/MS分析。通過報(bào)告離子（ReporterIons）的強(qiáng)度比值計(jì)算不同樣品間同一肽段的相對含量。

*優(yōu)點(diǎn)：混合后上樣消除分析波動(dòng)，多重樣本（最高16重）同時(shí)比較，定量精度高。

*缺點(diǎn)：標(biāo)記效率可能不均一，高價(jià)標(biāo)記試劑增加成本，通量受標(biāo)記重?cái)?shù)限制。

*適用場景：中通量蛋白質(zhì)組學(xué)差異分析（如細(xì)胞處理組vs對照組）。

2.非標(biāo)記法(Label-FreeQuantification,LFQ)

*操作：各樣品獨(dú)立進(jìn)行LC-MS/MS分析，通過比較色譜峰面積或MS1/MS2譜圖計(jì)數(shù)（如MaxQuant,Skyline軟件）計(jì)算目標(biāo)物在不同樣品中的相對豐度。需嚴(yán)格平行實(shí)驗(yàn)和歸一化處理（如總離子流校正）。

*優(yōu)點(diǎn)：樣本處理簡單靈活，成本低，無通量限制，適合大規(guī)模樣本。

*缺點(diǎn)：對實(shí)驗(yàn)重復(fù)性要求極高，色譜保留時(shí)間漂移影響比對，定量精度低于標(biāo)記法。

*適用場景：高通量蛋白質(zhì)組/代謝組學(xué)篩查（如臨床隊(duì)列研究）。

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關(guān)鍵步驟共通點(diǎn)

兩種方法均需：

1.色譜分離優(yōu)化（減少共洗脫干擾）；

2.質(zhì)譜方法優(yōu)化（選擇高特異性離子對，如MRM/SRM模式）；

3.嚴(yán)格質(zhì)量控制（標(biāo)準(zhǔn)曲線R2>0.99，QC樣品RSD<15%）；

4.數(shù)據(jù)規(guī)范化處理（消除系統(tǒng)誤差）。

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總結(jié)：外標(biāo)/內(nèi)標(biāo)法適用于精準(zhǔn)絕對定量，其中內(nèi)標(biāo)法抗干擾能力更強(qiáng)；標(biāo)記法與非標(biāo)記法則服務(wù)于大規(guī)模相對定量，分別在高精度與靈活性上各有優(yōu)勢。方法選擇需結(jié)合實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹颖緩?fù)雜度及成本綜合考量。